目前比較常用的方法有兩種:

(1)TaqMan熒光探針法:該方法在特異性探針的兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。當探針完整時,熒光基團發光被淬滅基團吸收;在PCR擴增過程中,探針被降解,熒光基團與淬滅基團分離,發出可被檢測到的熒光,以此來監測整個PCR過程。

(2)SYBR熒光染料法:該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結合并發光的特性,檢測PCR的全部進程,從而判定初始RNA的量。

常用的miRNA第一鏈合成方法
成熟的miRNA大小只有22 nt左右,在用實時熒光定量PCR檢測miRNA時,難點在于如何識別如此小的miRNA并合成第一鏈。目前常用的用于識別并合成miRNA第一鏈的方法主要有頸環法和加尾法兩種。

由于成熟miRNA較小,無法用常規的方法直接進行反轉錄、PCR。所以上述兩種方法分別加PolyA尾及頸環結構的方法,將miRNA配對的序列延長,然后進行正常的反轉錄及后續的PCR檢測。頸環法只針對成熟miRNA,特異性相對較高,但操作繁瑣,成本較高;加尾法可以檢測到成熟miRNA及pre-miRNA,特異性稍低,但操作及引物設計簡單。

分段探針捕獲miRNA
近年來,研究人員發現了越來越多的miRNA,其中有很多miRNA序列相近,有的僅僅只有一個堿基差異。這些不同的miRNA雖然序列相近,但是也有著不同的來源及功能。上述兩種方法雖然解決了miRNA的識別及后續PCR問題,但是無法分辨這些只有一個或者兩個堿基差異的miRNA。最近推出了一種新的miRNA識別方法,可以分辨僅有單個堿基差異的miRNA。